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小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2N HCl搅抖4小时，除去酸液，水洗到中性，再加4倍量2N
NaOH搅抖4小时，除硷液，
水洗到中性备用。将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。如希望阳树脂带Na＋，则用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂带H＋，可用HCl处理。阴树脂转型也同样，若希望带Cl…则用HCl，希望带OH…则用NaOH。用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。并非每次再一都用酸、硷液洗涤，往往只要转型处理就行了。
（二）柱上操作
⑴交换剂装柱最简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。
⑵上样向层析柱内倾入样品液
⑶洗脱与收集
不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。
胶色谱法
凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
一、基本理论
（一）分子筛效益
一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。
（二）色谱柱的重要参数
⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt
表示。
⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。
⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。
不包括固体支持物的体积（Vg）。
⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve
表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。
当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
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二、凝胶的种类及性质
（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）
⑴Sephadex
G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G…25为每克凝胶膨胀时吸水2。5克，同样G…200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G…10，G…15，G…25，G…50，G…75，G…100，G…150，和G…200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Sephadex LH…20，是─Sephadex G…25的羧丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：
商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio…Gel…A（美国Bio…Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4…9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：
是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，
由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P
（Bio…Gel P），由美国Bio…Rod厂生产，型号很多，从P…2至P…300共10种，P
后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ， 具有大网孔结构，
可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
三、实验技术
（一）层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，
直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20…30厘米，柱高与直径的比较5：1─10：1，凝胶床体积为样品溶液体积的4…10倍。
分级分离时柱高与直径之线为20：1─100：1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。
（二）凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex
G…20的吸水量为20，1 克Sephadex
G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100…200号筛目的的Sephadex
G…200效果好， 脱盐用Sephadex G…25、G…50，用粗粒，短柱，流速快。
（三）凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1…2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，
自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
（四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex
G…15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1…4％（一般约0。5…2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20…30％。
分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。
（五）防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：
⑴叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0。02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。
⑵可乐酮＇Cl3C…C（OH）（CH3）2＇在凝胶层析中使用浓度为0。01…0。02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。
⑶乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0。05…0。 01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
⑷苯基汞代盐
在凝胶层析中使用浓度为0。001…0。01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
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亲和色谱法
一、基本理论
（一）原理
在生物体内，许多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。亲和色谱法的基本过程是：
1。配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和性）。
2。亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。
3。解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。
（二）应用范围
亲和色谱可用于下列生物体系：
酶：底物、抑制剂、辅酶
抗体：抗原、病毒、细胞
外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体、
细胞核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶 、结合蛋白
激素及维生素：受体、载体蛋白
细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素
亲和色谱的优点是操作简便、效率高、条件温和，缺点是使用局限性大。
（三）载体的选择原则
用于亲和色谱的理想载体应具有下列特性：⑴不溶性：不溶于水；⑵渗透性：疏松网状结构，容许大分子自由通过；⑶有一定硬度，最好为均一的珠状；⑷具有大量可供反应的化学基团，能与大量配基共价连接；⑸非特异性吸附能力极低；⑹能抗微生物和酶的侵蚀；⑺有较好的化学稳定性；⑻亲水性。选择配基根据对纯化大分子的特异性的全面认识。
选择也的配基有两条标准：
第一是蛋白质和配基之间必须有强的亲和力，解离常数在5mM以上不是好配基；
相反亲和力太高也是有害的，因为在解离蛋白质──配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作配基纯化含生物素的羧化酶时，生物素──抗生物素蛋白复合物的解离常数达10…15M，解离时需要pH1。5，6M盐酸胍，在这种条件中。羧化酶大多数已经变性。
选择配基的第二个标准是，配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结合，但可用于活化和载体相连接，同时又不影响配基与蛋白质之间的亲和力。
（四）常见载体的特性
琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose）
聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。
葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔经小。
纤维素： 非特易吸附严重，廉价，易得。
二、实验方法
亲和色谱分离的方法随每种分离物质的不同而有不同。一般推荐使用的程序如下：
1选 择 配 基；2选择偶联凝胶；3偶 联 配 基；4装填合适的柱；5平衡（2…3倍体积缓冲液）；6应 用 样
品；7洗涤未结合物质；8洗脱结合物质→除盐；9再生
高压液相色谱
Martin 和
Synge在1941年就提出高效相色谱的设想，然而直到六十年代后期，由于各种技术的发展，高效液相色谱才付诸实现。这种色谱技术曾被称为高速液相色谱（HighSpeed
Liquid Chromatography），高压液相色谱（High Parss…ure Lipuid Chromatography），目前使用最多的名称是高效液相色谱（High Pe…rformance Liauid
Chromatography，HPLC）。高效液相色谱已经广泛地应用，成为一项不可缺少的技术。它的主要优点是⑴分辩率高于其它色谱法；⑵速度快，十几分钟到几十分钟可完成；⑶重复性高；⑷高效相色谱柱可反复使用；⑸自动化操作，分析精确度高。根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别，高效液相色谱可分为四个基本类型，即液－固色谱、液－液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有机酸；⑶甾体化合物；⑷生物硷；⑸抗菌素；⑹糖类；⑺卟啉；⑻核酸及其降解产物；⑼蛋白质、酶和多肽；⑽脂
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一、分类
高效液相色谱法可分为四个基本类型：即液－固色谱法，键合相色谱法，离子交换色谱法及体积排阻色谱法。
（一）液－固色谱法
液－固色谱法通常称吸附色谱法，吸附剂有活性碳，氧化铝和硅胶，在液－固色谱法中用的载体都是硅胶。硅胶对溶质，分子的吸附能力不是平均分布在整个硅脱表面的，在硅胶表面有一些区域与溶质分子强烈相互作用，这些区域为活性位置，硅胶与溶质分子间主要作用是偶极距力氢键及静电相互作用。极性越强，而化合物在硅胶柱上的滞留时间也长。在液－固色谱中，依靠流动相溶剂分子与溶质分子竞争固定相互活性位置，
从而使溶质从色谱柱上洗脱下来。与硅胶表面活性位置结合力强的溶剂洗脱溶质分子的能力强，因而称强溶剂，反之为弱溶剂。液─固色谱法的特点是适于分离色谱几何异构体，可用于脂溶性化合物质如磷脂，甾体化合物，脂溶性维生素，前列腺素等。
（二）键合相色谱法
键合相色谱法是由液－液色谱法即分配色谱发展起来的。键合相色谱法将固定相共价结合在载体颗粒上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。键合相色谱法可分为正常相色谱法和反相色谱法。
1。正常相色谱法
在正常相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团，如一级氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流动相溶剂是与吸附色谱中的流动相很相似的非极性溶剂�