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实验室手册
ＬＡＢＯＲＴＯＲＹ ＨＡＮＤＢＯＯＫ
（兼作研究生兽医免疫学实验技术指导讲义）
焦新安 编
江苏农学院传染病教研组
一九九三年三月前言
实验室是进行教学和科学研究的重要基地，为适应教学、科研及实验室建设和管理的迫切需要，笔者根据教研室的教学、科研实践情况，以力求简明和实用为宗旨汇编了这本《实验室手册》，共分四个部分，其中第一、第二部分适于实验室管理和研究生等人员的实验工作基本素质和基本技能的训练；第三部分可用作研究生兽医免疫学实验指导，亦可供有关教学人员参考；第四部分是作为家畜传染病学实验课教师参考教材。整个手册反应了近年来家畜传染病教研室在教学、科研、教书育人方面的最新成果，可供同类生物学实验室交流和参考。
在编写过程中得到刘秀梵教授和张如宽教授的审阅和大力支持，室内其他同志亦提出了许多宝贵意见，特此致谢！由于时间仓促和编写水平有限，经验不足，错误之处诚望读者不吝指正。
编者
１９９０年６月
１９９０年我们试编的《实验室手册》得到了校内外读者的大力支持，并得到了许多宝贵意见，该手册正在补充修改之中，可望近期脱稿。
为了满足研究生兽医免疫学实验技术和部分家畜传染病学实验技术的教学等急需，我们稍作调整后重印部分手册。恳请读者继续提出宝贵意见！
编者
１９９３年３月
目录
第一部分 实验室工作手册
第一章 总则７
附：实验室一般规则
第二章细则９
第一节 无菌室工作须知９
第二节 送洗须知９
第三节 试剂的保存和使用须知１０
第四节 菌种、毒种和细胞株保存须知１１
第五节 超低温冰箱和液氮罐使用须知１３
第六节 高值仪器使用须知１４
第七节 常用小型仪器使用须知
第八节 实验记录须知
第九节 值日工作人员的职责须知
第十节 文献资料查阅须知
第十一节 试验准备须知
第十二节 其他注意事项
第二部分 常用仪器的操作程序及使用注意事项
第一节多功能紫外可见分光光度计
第二节酶联免疫阅读仪
第三节电子天平
第四节各类显微镜及显微摄影技术
第五节核酸蛋白检测仪
第六节各类离心机
第七节酸度计
第八节各类冰箱的使用和保养
第九节电泳装置
第十节空调机、抽湿机、超静工作台
第十一节自动颗粒制冰机
第十二节其他仪器设备
第三部分实验室常规试验程序
第一章 组织培养及常用溶液的配制
第一节鸡成纤维细胞（ＣＥＦ）、鸭成纤维细胞（ＤＥＦ）培养
第二节组织培养溶液配方
第三节配制溶液注意事项
第二章淋巴细胞杂交瘤技术及使用溶液的配制
第一节配合程序
第二节溶液配方
第三节单抗制作技术中的其他方法
第三章组织培养使用物品的准备
第一节一般原则
第二节玻璃器皿的准备
第三节橡皮制或塑料制品的准备
第四节其他用品的准备
第五节纯水制备程序
第六节新生犊牛血清的制备
第四章酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）的程序
第一节间接ＥＬＩＳＡ试验
第二节直接ＥＬＩＳＡ试验
第三节夹心ＥＬＩＳＡ试验
第四节竞争ＥＬＩＳＡ试验
第五节ＤＯＴ－ＥＬＩＳＡ试验
第六节酶标组化法
第七节ＥＬＩＳＡ常用溶液的配方
第八节酶标抗体的制备
第五章免疫荧光试验的程序
第一节脂多糖敏化甲醛化绵羊红细胞的制备
第二节蛋白质敏化ＳＰＢＣ的制备
第三节ＰＨＡ试验程序
第七章免疫胶体金试验程序
第八章免疫球蛋白亚类测定
第一节免疫扩散法
第二节ＥＬＩＳＡ法
第九章免疫血清制备
第一节 免疫球蛋白提取与纯化
第二节 几种常见抗原的制备
第三节 抗血清的制备程序
第十章细菌学试验种的几个常用技术
第一节细菌学总数估测
第二节几种常用培养记得配方
第三节常用细菌的分离鉴定程序
第十一章细胞免疫学试验程序
第一节玫瑰花环试验
第二节淋巴细胞转化试验
第十二章动物试验的一般规则
第十三张电泳技术、层析技术
第十部分家畜传染病学试验指导
家畜传染病学试验规则、实验报告内容
实验一炭疽的诊断
实验二巴氏杆菌的诊断
实验三结核杆菌病和布鲁氏杆菌的检疫
实验四猪瘟的诊断
实验五鸡新城疫的诊断
Ｉ鸡新城疫病病毒的鸡胚分离
ＩＩ免疫荧光实验
ＩＩＩ血凝和血凝抑制实验
实验六鸡马立克氏病的琼扩诊断
实验七沙门氏菌快速检测技术
实验八鸡白痢的检测
第一部分 实验室工作守则
第一章总则
一、 严禁在实验室内吸烟、饮食（办公室除外）；严禁挪用公物。
二、 所有物品用后立即归回原处。
三、 菌种、毒种严禁带出实验室。
四、 各种病毒材料在废弃前应做好无害化处理。
五、 爱护仪器设备，用后做好清洁整理工作。
六、 使用高值仪器前仔细阅读仪器说明书，严格遵守操作规程进行操作。初次使用应在有关老师或工作人员指导下进行。
七、 损坏器皿和仪器需登记，并及时向有关负责老师汇报。
八、 坚持用水、用电安全，使用电炉时不得离开现场，下班时检查水电，锁紧门窗。
九、 厉行节约。在一切工作中树立节约精神，培养集和各种溶液用多少配多少，可以回收的东西及时回收。节约用电，随手关灯。
十、 值日人员应履行职责，并督促其他工作人员做好实验后的整理工作。
十一、 实验室内所有资料阅后放回原处，一般不得带出实验室，特殊情况下需借阅，应经过批准，并登记。
十二、 每进行一个试验需事先提出实验设计，列出所需材料及药品清单和经费预算（一式二份）。报请批准后付诸实施（交批准任一份）。
十三、 领用或购置药品和器材需事先列出申请（一式二份），写明用途并报请批准（交批准人一份）。
十四、 新进入实验室工作的研究生须经过一段时间的工作训练。熟悉实验室工作守则，掌握各种器材的清洗消毒等准备工作，掌握各种仪器的使用和保养方法。
十五、 每周六下午为教研室例会（学术汇报和讨论，工作总结和安排）和室内外卫生大扫除。
附一、实验室一般规则
一、 实验事是进行教学和科研的重要基地，是办好学校的基本条件之一。实验室人员应忠诚党的教育事业，认真贯彻党的教育方针，为培养四化建设有用人才尽职尽责。
二、 实验室要坚持改革，按照勤俭办学的原则，少花钱，多办事，办好事，注意提高效益，反对浪费。
三、 实验室以实验教学为主，在保证教学和科研任务的前提下，可以充分利用现有的技术和设备条件，积极开展技术服务工作。
四、 实验室应保持肃静、文明、整洁的工作环境和良好的秩序，实验室严禁吸烟，无关人员不得进入实验室，院外人员到实验室参观学习，须经主管部门同意或院领导批准。
五、 加强科学管理，建立健全必要的规章制度如各类人员的岗位责任制，仪器设备和物资材料使用报关制度等。
六、 加强安全，剧毒物品要严格领用。对易燃易爆、有毒放射性等有害物品，单独存放，并且指定专人保管，严禁随意乱放和擅自挪用。
七、 实验室人员和学生在实验前应做好充分准备，熟悉实验内容和操作规程，精心实验。
八、 学生进入实验室学习，实验室人员应向学生进行勤俭节约、安全，以及有关科技保密等方面的教育，精心指导，确保实验课顺利进行。
九、 实验人员对实验室仪器要定期清点，维护保养，开展以仪器完好率、安全、卫生等评比活动，对成绩显著的个人和集体进行表扬和奖励。对工作不负责造成损失者进行批评教育直至经济处罚和行政处分。
第二章细则
第一节无菌室工作须知
一、 无菌室内非请莫入，非本实验室人员未经批准不得在无菌室内工作。
二、 所有药品器材均为无菌室专用，一般不得带初无菌室，作为其他用处。
三、 所有物品用后立即放回原处。
四、 进入无菌室工作之前需修剪指甲，手清洗后在用１％新洁尔灭溶液洗手消毒，换鞋进入，使用超静台需着无菌室专用工作服并用酒精棉球擦手消毒。超静台每次使用后都应仔细做好清洁整理工作。
五、 卫生值日人员要勤打扫。注意保持无菌室的相对无菌条件，经常用新洁尔灭溶液擦洗地面、桌面、台面和试剂厨。经常将无菌室工作服送至洗涤室清洗消毒，使用后的鼠尸及鼠笼随手带出无菌室。每日为除湿机倒水。注意无菌时使用药品、物品的消耗，及时通知工人准备，或汇报负责老师以便补充。
六、 配培养基和其他试剂都应有记录，瓶子上映注明品质、浓度、日期及配制人，使用过的培养基及无菌试剂应自觉注明使用人姓名，以防止交叉污染。
七、 严格控制细胞之间或病原之间的交叉污染，容易发生交叉污染的细胞或病毒不能在同一超净台内处理。
八、 扭力天平使用之后应休止，在将读数盘回零，托盘及天平表面擦洗干净，药勺也应洗净擦干。使用后的药品应将盖拧紧，放回原处。
九、 离心机使用时应注意平衡，使用后将离心杯、橡皮套管清洗干净，倒置晾干。
十、 ＣＯ２孵箱为通气培养箱，应自觉维护箱内清洁，定期将托板、托盘换出消毒。如培养瓶内培养基漏出，立即用酒精棉讲瓶外表面迹箱内污迹擦拭干净，箱内蒸发用水威无菌蒸馏水，应注意补充。四周水箱内的水定期补加。ＣＯ２浓度、温度控制器等零部件请勿动，发现问题及时报告。
十一、 组织培养用眼科剪刀镊子使用后应洗净烘干，防止生锈。
十二、 浸泡细胞培养板统一使用７５％酒精（ＣＰ或ＡＲ）或医用酒精。
第二节 送洗须知
一、 送入洗涤室的所有物品均应分类置于指定的地方；以便洗涤。
二、 被病原材料污染的器械物品等在送洗之前作无害化处理和面交洗涤室工作人员，并详细说明处理方法。
三、 送洗的所有玻璃、塑料器皿都应冲洗后浸泡于自来水中。使用的金属滤器应仔细冲洗后，完全浸泡于水中。包扎滤器用的牛皮纸和纱布可重复使用，应置于干燥箱内烘干。
四、 注意节约。可以重复使用的物品如离心管塞、牛皮纸和沙布等不应废弃。
五、 注射器、针头、剪刀、镊子、微量吸样器用塑料滴头，高速离心机用塑料离心管皆由使用者自己清洗、烘干，并放回原处。
六、 每一实验若需较大量的物品或一些特殊用品，应提前通知洗第室工作人员准备，特殊洗涤要求要当面交待。
第三节试剂的保存与使用须知
一、 化学试剂在保存与使用过程中往往会因为自身物理化学特性和环境条件的变化发生变质。化学试剂的变质分为潮解、霉变、熔化、凝固、变色、聚合、氧化、腐蚀、挥发、风化、升华和失效等。影响化学试剂变质的主要因素为水分、氧气、光辐射和温度等。
二、 化学试剂的保存温度分为室温、４℃、冰冻（－２０度）和超低温（－７０度以下）等。应根据化学试剂的物理化学特性和瓶签要求分别保存于不同温度条件下。
三、 化学试剂一般都应密闭、干燥保存。有些化学试剂（如氧化钙、乙酸钾、硝酸钙和氯化钙）极易从空气中吸收水分而潮解或分解变质。这些化学试剂要特别注意密闭、干燥。有些生物制剂（如酶和荧光素）不仅需要低温保存，而且很易吸潮而变质失活。这类药品应置于干燥器中冰箱内保存，使用这类试剂要注意需待干燥器内温度升高时方可开启干燥器上盖，以防在干燥器内开成水汽。
四、 根据试验要求选用不同纯度的化学试剂。不可超级使用，但也不要降级使用。（见附表）
五、 使用进口药品和贵重药品需办理申请批准手续。取用时进行登记。
六、 有毒药品要由专人保管，使用过程中一定要注意个人保护和环境保护。
七、 所有化学试剂使用后拧紧瓶盖，立即回到原保存条件下。
八、 同一种药品一瓶未用完之前不得开启或领用新瓶。
九、 每一种药品使用一个药勺。注意防止试剂间相互污染。药勺使用后应立即洗净。
十、 严禁将化学药品用作食用或作燃料。
附表 我国化学试剂的等级标志
试剂级别 中文名称 代号 瓶签颜色 使用要求
一级品 保证试剂或“优级纯” Ｇ．Ｒ． 绿色 用作基准物质，主要用于精密的科学研究和分析鉴定
二级品 分析试剂或“分析纯” Ａ．Ｒ． 红色 主要用于一般科学研究和分析鉴定
三级品 化学纯粹试剂或“化学纯” Ｃ．Ｐ． 蓝色 用于要求较高的有机或无机化学实验，也常用于要求较低的分析实验
四级品 实验试剂 Ｌ．Ｒ． 棕色或蓝色或其他颜色 主要用于普通的实验和科学研究上，有时也用于要求较高的工业生产中
第四节 菌种、毒种和细胞株保存须知
一， 菌种、毒种和细胞严禁携出实验室。其它实验室如需引进，须经过负责老师批准，并办理有关手续。
二， 所有菌种、毒种和细胞都应专用登记本上按规定项目详细登记，请参阅有关登记本目录说明。
三， 根据保存物不同要求保存于不同条件下。一般分为…30，超低温（…70以下）和液氮保存。
四， 越低温冰箱内按位置分类存放，液氮贮罐分类存放。
五， 菌种、毒种和细胞在接种继代时应严格防止交叉污染。
六， 取出时必须在登记本上登记。
第五节 超低温冰箱和液氮贮罐使用须知
一， 超低温冰箱使用须知
1， 超低温冰箱仅限于存放毒种，菌种，血清抗体、单抗腹水、药品试剂和某些病料等。
2， 放入箱内所有制物品必须按规定位置分类存放。取放都应在登记本上登记。
3， 箱门开启时应尽可能短暂，关门后锁紧扣好。严禁在停电时开启箱门。
4， 及时清理、剔除无保存价值的物品。
二，液氮罐使用须知1，液氮容器分为二类。一类为贮存容器，这类容器保存液氮时间长，主要用于静置贮存液氮，存放时应保持垂直，切不可充装液氮后倾倒。可以空载运输，但不可在充满液氮下作长或短途运输。另一类为运输容器，这类容器耐冲击震动，可充装液氮后作长短途运输。
2，只能使用配套瓶封闭颈口，不可用其它不合格物代替。否则会因液氮持续蒸发，形成压缩气压，导致致容器的损坏或爆炸。
3，容器首次充满液氮以及停用后重装，因内胆是常温，开始充装时切勿太快，以免液氮剧烈沸腾，向外飞溅。
1、
2、 容器首次充满液氮以及停用后重新充装，因内胆是常温，开始充装时切勿太快，以免液氮剧烈沸腾，向外飞溅。
3、 加注液氮时不要将液氮冲在颈管上（应使用漏斗加注液氮），液氮不宜充装过满，切勿使液面高到与玻璃钢颈管接触。
4、 取放冰存物时应细心谨慎操作，要注意尽量缩短颈口开放时间，避免吸入空气中水份影响贮存效果。
5、 如发现液氮蒸损量突然增多或外壳上部的金属表面突然结霜，说明容器已经损坏，应立即停止使用。
6、 存放细胞需使用统一规格的布袋，引绳要牢靠。
7、 存放细胞后登记，并统一编号。取出细胞后也在登记薄上登记，禁止取存细胞不登记不现象。
8、 保持液氮罐的线头齐整，经常清理弃去无保存价值的细胞。
第六节 高值仪器使用须知
一、 使用高值仪器前需仔细阅读仪器说明书。初次使用时应在有关人员指导下进行。
二、使用过程中如发现故障，应立即报告有关人员。
三、使用高值仪器必须登记，使用后做好清理工作，加盖防尘罩。
四、高值仪器由专人负责。负责同志做好仪器的调试保养和监督使用工作。
五、非本室工作人员使用高值仪器需经批准。并需由本室工作人员都督使用。
第七节 常用小型仪器使用注意事项
一、 电子交流稳妥压器
1 连续工作时间一般不要超过6小时。
2、关机后需待5分钟方可重新开启电源开关。
二真空泵
1使用前查看没油位。以停泵时注油标中心为宜。
2、泵进气口连续通畅大气运转不得超过1分钟。
三、电动吸引器
使用前观察润滑油是否正常（油面应在油镜中央）。若油面偏听偏低，应随时加注。
四、小型台式离心机
1、电机要三个月加注润滑油一次。
2、碳刷磨损小于10mm时应调换新碳刷。
3、试管、试管套都应对称平衡。严禁在重量非相等时使用。
五、手提式高压蒸气消毒锅
1、每次使用前应检查器内水量是否保持3立升左右。
2、对溶液消毒，应灌�