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成功范例：检测伤寒、鸡白痢抗体等。
第五节 Dot—ELISA
1、 根据实验要求不同，选用硝酸纤维膜，混合膜或醋酸膜，并切成条带，以硬模压痕迹；
2、 以蒸馏水或TBS浸泡膜条带，取出晾干后备用；
3、 抗原包被：
（1）、可溶性抗原（ug/ul），每点点加5ul，37℃烘干；
（2）、全菌抗原（1X10（6）/ml），每点点加5ul；37℃烘干，可先将条带经5％GA处理后，37℃3h或4℃过夜，再加样烘干。
4、 TBS/NCS或BSA封闭；
5、 漂洗；
6、 将膜转入酶标抗体内，37℃0。5…2h；（间接法步骤是：先于第一抗体中浸染漂洗后，转入酶标第二抗体中反应）。
7、 漂洗；
8、 把膜置入DAB或4—氯—1—萘酚底物中显色，室温10—30分钟；
9、 漂洗；
10、 晾干后，判读结果（可以进行扫描分析）。
成功范例：脂多糖抗原检测，大肠杆菌检测 ，单克隆抗菌素体筛选等。
第六节 酶标组化法
1、 抗原准备：
（1） 细胞涂片：
（2） 病变组织触片或冰冻切片；
（3） 生长细胞的培养孔或玻片；
2、 4℃丙酮固定10分钟；
3、 灭活内源酶：
将待检玻片浸入内源酶灭活液内，或于培养孔内加入内源酶 灭活液，室温灭活30分钟，弃去灭活液，以PBS和去离子水充分洗涤10—20分钟，自然干燥；
4、 以PBS/NCS封闭，37℃2小时或4℃过夜；
5、 酶染：加酶标抗体反应（或间接法步骤进行）37℃1—2小时，并设立对照；
6、 PBS洗15分钟表；
7、 以DAB显色，室温避光30分钟；
8、 镜检：细胞浆呈棕黄色，细胞 核无色，阴性对照无色，判为阳性。（4—氯—1—萘酚 显色）。
成功范例：猪瘟组化法诊断。
第七节 ELISA常用溶液的配方
一、 包被液
1、 碳酸盐绶冲液
0。2M Na2CO3： 12g无水Na2CO3＋100ml去离子水
0。2M NaHCO3：1。68g NaHCO3＋100ml去离子水
取0。2M NaCO3：8ml，0。2M NaHCO3：17ml混合再加75ml去离子水；调PH至9。6。
2、 Tris—HCL绶冲液（PH6。0；0。02M）
0。1N Tris 100mｌ
0。1N HCL 58。4ml
培养离子水加至1000ml
（Tris MW 121。14）
3、 其它包被方式，如（GA、MA、BSA等方法，请参阅有亲章节和文献。
二、稀释和封闭液
1、 EPBA（PH7。2）
NaCL 80g Na2HPO4。12H2O 14。5g
KCL 2g KH2PO4 2g
去离子水10升
2、 EPBS/Tween—20/NCS：
EPBS＋0。05％Tween—20＋10％NCS or ！％BSA
3、Tris—HCL绶冲液 PH7。0 0。01M
0。1M Tris 50。0ml
0。1N HCL 46。5ml
NaCL 8。5g
BSA 50g
正常山羊血清150ml檬酸：
去离子水1000ml
三、洗涤液
1、 EPBS/Tween—20
EPBS＋0。05％Tween—20（或80）
2、 Tris—HCL/Tween PH7。4 0。02M
1。0M Tris 20ml
1。0N HCL 15ml
1。0N HCL 15ml 调PH至7。4
Tween—2。0 0。5ml
DW 加至于1000ml
四、底物溶液
1、 磷酸盐—柠檬酸绶冲液（NO。1）
0。1M 柠檬酸：10。5g C6H6O7。H2O＋DDW500ml
0。2M Na2HPO4。12H2O＋DDW1000ml
取24。3ml0。1M柠檬酸、25、7ml0。2M NaHPO4再加50mlDDW
注：柠檬酸溶液 及配成的底物绶冲液不稳定；易形成沉淀；因此一次不宜配制过多。
2、 OPD（邻苯二胺）底物
NO。1底物绶冲液 10ml
OPD 4mg
3％H2O2 40ul
3、 TMBS（四甲联苯胺硫酸盐）
TMBS贮液：10mg/ml DMSO 4℃避光存放。
TMBS贮液 100ul
NO。1底物绶冲液 10ml
1％H2O2 25ul
4、0。05M PH 7。6 Tris_—HCL缓冲液
0。1M Tris 50ml
0。1N HCL 38。5ml
DW至100ml
5、TBS buffer （NO。2
20 Mm Trisbase
500Mm NacL
adjusted to PH7。5 With HCL
6、 DAB（二氧基苯胺盐酸）底物
DAB 75mg
NO。2底物绶冲液100ml
避光搅拌3小时；使其溶解；滤纸过滤。临用前加1％H2O2 0。5ml
7、4—氯—1—萘酚底物（4CN）
（1） 4CN贮液：3mg 4CN溶于是ml甲醇中，4℃保存；
（2） 使用液：2ml 4CN贮液＋10mlTS buffer＋H2O2至0。01％（V/V）
7、 酶反应终止液
2m H2SO4
浓H2SO4 10ml溶于80ml DW
六、内源酶灭活液：
0。01％H2O2；NaN；PH7。6 0。05M Tris—HCL绶冲液：
取PH7。5 0。05M Tris—HCL绶冲液98ml，加1％H2O21ml 1％ NaN 1ml即成。
第八节 酶标抗体的制备
一、 1、 试剂
1、 0。1M NaHCO3：0。84gNaHCO3＋DDW 100ml
2、 0。1M Na2CO3：1。06g Na2CO3…DDW 100ml
3、 EPBS：同第七节
4、 10mM NaIO4 204。0mg NaIO4＋DDW 100ml
5、 0。1mM NaOH
6、 5mg/ml NaBH4：0。1g NaBH4＋0。1mM NaOH 20ml
二、 HRP直接标记腹水中单抗
1、 5mg HRP溶于0。5ml 0。1M NaHCO3
2、 加0。5ml 10mM NaIO4，混匀，盖紧瓶塞
3、 室温（20℃）避光作用2h
4、 加0。75ml 0。1M NaCO3，混匀
5、 加0。75ml小鼠腹水，混匀
6、 用少许PBS将交联物转移到一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中
7、 加Sephadex G15或50干粉0。5g，混匀。盖紧，室温作用（避光）3h
8、 用少许PBS将交联物全部洗出
9、 收集洗出液，加1/20V新鲜配置的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟
10、 再加3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1h或4℃过夜
11、 将交联物过Sephdex G200或Sepharose 6B（2。5*50cm）层析纯化，分管收集第一峰
12、 酶结合物质量鉴定：
（1） 克分子比值测定
酶量（mg/ml）=OD403*0。4
Ig量（mg/ml）=（OD280…OD403*0。3）*0。62
酶结合物克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量
标记率=OD403/OD280
E/P值为1…2之间合格
（2） 特异性及效价测定：应用ELISA同时确定酶结合物的特异性，酶活力，抗体活性及效价。
将酶结合物对倍稀释后平行加于阴性孔及阳性孔，合适底物显色后记录各个稀释度的特异及非特异显色值，绘制特异及非特异反应曲线，比较二条曲线可以确定其特异性，酶活力及抗体活性。特异显色为1。0时的稀释倍数，一般可作为交联物的效价。实际使用浓度应适当升高2…5倍。
13、 酶标记抗体的保存：加等量甘油（A。R）后，…20℃存放。
三、 HRP标记提纯抗体制剂：（纯化抗体请参见有关章节）
（一） HRP 的活化
1、 5mg HRP（RZ》3。0）溶于0。5ml新配制的0。1M NaHCO3试管中；
2、 在上述溶液中加入0。5ml 10mM NaIO4，试管加塞塞紧，20℃暗处放置2h
3、 加0。1ml 0。1M Na2CO3以减慢氧化
（二） 标记
1、 用0。1M Na2CO3（Ph9。2）（1…2ml）配制15mg Ig溶液
2、 将Ig溶液加入HRP溶液（HRP：IgG分子比为1：2）
3、 立即将IgG…HRP混合液移入5ml注射器外筒（下口塞有玻璃棉，并接上橡皮帽），加入混合液重量的1/6 Sephadex G25或50干粉；室温3h或4℃过夜
（三） 稳定化
1、 用少许PBS洗脱酶标记物
加入1/20V的NaBH4酶标记物中；室温作用30分钟，加入3/20V的NaBH4，室温作用1h（可与4℃过夜）
（四） 提纯同前。
（五） 酶结合物质量鉴定及保存，同前。
成功范例：酶标记大肠埃希氏菌粘附素单抗，沙门氏菌O、H抗原单抗，NDV单抗，羊抗鼠Ig抗体等。
第五章 免疫荧光试验程序
第一节 间接免疫荧光试验
一、 抗原制备
1、 固定细胞片的制备：
生长在盖片上的细胞（接种或未接种病毒），可直接收获盖片，在PBS中洗涤，用4℃100％丙酮固定2分钟，空气干燥，置密封容器于—20℃保存备用；单元细胞 悬液可在盖片上制成涂片，固定方法同上。
2、 单细胞 悬液制备：
用含0。1—1％BSA和0。1％的叠氮钠的PBS洗2—3次。注意所有各步需在4℃进行！经细胞 计数，调节细胞 浓度至10（7）/ml，可供作活细胞 的膜荧光染色。
3、 细菌涂片的制备：
将10ul细菌悬液（1X10（6）个/ml）涂沫7X21mm盖玻上，自然干燥后，用—20℃丙酮固定10—15分钟，于—20℃保存备用。
4、 病变组织触片的制备，按常规方法。
5、 病变组织冰冻切片的制备。
二、抗体染色及结果观察
1、 盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10—20ul杂交瘤上清或其它待检样品，设立阳性、阴性对照。
2、 37℃水浴 孵育0。5—1h。
3、 盖片在PBS（PH7。4；0。01M）中用磁力搅拌器洗涤15分钟。
4、 取出盖片置架上；滴加工作浓度己测定的荧光第二抗体。
5、 37℃孵育0。5—1h。
6、 洗涤15分钟。
7、 取出盖片，用延缓荧光猝灭的封载剂封存于干革命净玻片上。
8、 在荧光显微镜下观察：
阳性结果：可在细胞 浆，或细菌外周，或细菌粘附素鞭毛等可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光）。
成功范例：粘附素单抗检验，O抗原单抗检验、NDV单抗检验、NDV诊断等。
附一：活细胞的膜荧光染色
1、 在小试管中加入100ul单细胞悬液后，再加100ul第一抗体，并混匀。在冰浴上孵育30—60分钟。
2、 将细胞 重新悬殊浮1—5ml洗涤剂中，以400g离心5分钟洗涤，重复一次。
3、 以100ul洗涤剂悬浮，加工厂100ul荧光抗体，置冰浴30—90分钟。
4、 洗涤2次
5、 将细胞 重新悬浮于20—30ul含水量10％ 甘油，10—100ug苯二胺（）ml的洗液中（PH7。0左右）滴于载玻片上；加盖玻片封载。
6、 立即在显微镜下检查；细胞亦可在染色后用1％多聚甲醛生理盐水固定；立即检查；或至少在4℃可保存一周。
成功范例：NDV单抗膜荧光染色
附二：
1、双重染色：标本中有两种不同抗原；可用FITS和RB200；分别标记 两种抗体；同时或先后反两种荧光抗体进行染。 2、反衬染色：对于组织标本，为了加强特异性荧光的鲜明性，常需使用反 衬染色。最常用者为伊文氏蓝（1：10000—1：100000），它发射红色荧光，可反衬出FITC的黄绿色荧光。
附三：
1、 PH7。4 0。1M磷酸缓冲液
Na2HPO4。12H2O 28。94g
KHPO4 2。6g
DW 1000ml
应用时取上述贮存液100ml；加入NaCL8。5g；加DW至1000ml；即为PH7。4 0。01M PBS。
2、缓冲甘油
SoL。Ι
甘油（A。R。） 9份
PBS 1份
SoL Ⅱ
甘氨酸 0。42g
NaOH 0。021g
NaCL 0。51g
NaN 0。03g
D。W。 至30ml
加入 70ml
第二节 直接免疫荧光试验
1、 抗原制备同前
2、 加染荧光素标记的特异抗体。
3、 37℃温育30—60分钟。
4、 洗涤15分钟。
5、 取出盖片，完全干燥后，用封片油封于干净的勒玻片上。
6、 镜检
成功范例：沙门氏菌快速检验，NDV诊断。
第三节 荧光抗体的制备
一、 试剂
1、 PH9。3碳酸盐缓冲液
无水Na2CO3 8。6g
NaHCO3 17。3g
D。D。W 1000ml
2、 PBS（PH7。4，0。01N）同前
3、 二甲基亚砜
二、标定程序
1、 以碳酸盐缓冲液调整蛋白浓度至10mg/ml；（腹水单抗可直接用碳酸盐缓冲液稀释；提纯的抗体IgG，需经SephadexG25柱层析或透析方法转换缓冲体系至碳酸盐缓冲液）。
2、 取代5ml抗体溶液于10ml小烧杯内，磁棒轻搅。
3、 称取1mlFITC溶解于0。2mlDMS中。
4、 待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内。
5、 20℃闭光作用2h，可不搅拌。
6、 将交联反应后的溶液经SephadexG25或G50柱析层除去游离的荧光素。
7、 收集第一峰为标记的抗体。
三、FITC结合物质量鉴定
1、 测定F/P比值：
OD100…0。35XOD495
＇IgG＇（mg/ml）=——————
1。4X
F/P=2。87
抗IgG荧光抗体F/P比不宜高于1…2；抗细菌荧光抗体F/P可允许高于2，乃至高标记（F/P10——15）。
2、 特异性及效价测定
以标记抗体染色各种抗原的盖片，同时测定其特异染色滴度和非特异染色滴定，并观察抗体活性。
四、标记抗体的保存
标记抗体宜保存于4℃；
或加50％甘油（A。R），…20℃冻存。
成功范例：沙门氏菌O抗原单抗标记，羊抗鸡IgG的标记抗体的制备等。
第六章 间接血凝试验的程序
第一节 脂多糖敏化甲醛化绵羊红细胞的制备
一、 甲醛化绵羊红血球制备：
（一） 醛化血球试剂：
1、PH7。2 PBS
NaHPO4。12H2O 3。5816g
KH2PO4 0。4082g
NaCl 8。014g
D。W。 1000ml
3、 双倍离子强度的PH7。2PBS
Na2HPO4。12H2O 0。3581g
KH2PO4 40。82g
NaCl 0。814g
D。W。 50ml
4、 抗凝保存液（即Alsever氏液）
枸椽酸钠 0。8g
枸椽酸辣 0。055g
氯化钠 0。42g
葡萄糖 2。05g
D。W。 1000ml
5、 甲醛（A。R。或C。P。）：临用前用双倍离子强度的PBS作对稀释；配成20％的甲醛。
6、 饱和硫酸铵溶液：按25℃饱和溶解度配制。
（二）、步骤：
1、 无菌采集绵羊颈静脉血50ml，用要枸椽酸钠作抗凝剂；
2、 用5倍于红细胞压积的PH7。2PBS充分洗涤5次；每次1500rpm5___10分钟；直至上清测定无蛋白质（用饱和硫酸铵滴定上清；观察有无白色沉淀）；再以相同缓冲液配制成25％SRBC悬液；
3、 25％SRBC与20％甲醛以25：1的比例混匀；37℃水浴作用2小时；每15分钟振荡一次；红细胞颜色由红色转变为棕色；
4、 取出；以PH7。2PBS洗涤4次；每次2000rpm10分钟；再加同样的PBS；制成25％SRPB；
5、 重复第三步醛化一次；同法洗涤；
6、 最后配制相当于20％醛化SRBC悬液；并加入侵。3％甲醛（最终浓度）或者0。01％硫柳汞防腐；分装；4℃保存备用。
二脂多糖抗原制备___热酚水法
1、 菌泥悬浮于100ml水中，或20g菌粉悬于350ml水中；
2、 将新配的90％（V/V）苯酚（最好是新蒸的）预热至68℃—70℃；
3、 加酚液于菌液中，至酚的最终浓度为45％，68℃水浴作用25分钟，并充分振荡；
4、 冷却至10℃左右，12000rpm30分钟，离心管内分层情况依次是：水层、蛋白质层、酚层和沉淀物。
5、 小心吸取上清，（准备透析袋）
6、 余下部分再加水80ml，68—70℃水浴维持30分钟，冷却至0℃左右，离心吸水层；
7、 将水层提取物装入透析袋，流水透析1天