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5、 小心吸取上清，（准备透析袋）
6、 余下部分再加水80ml，68—70℃水浴维持30分钟，冷却至0℃左右，离心吸水层；
7、 将水层提取物装入透析袋，流水透析1天，蒸馏水透析2天；
8、 收集粗品LPS，冻存备用。
三、蒽酮比色定糖法—测定粗制LPS的多糖含量。
1、 原理：蒽酮可以和游离的或多糖中存在的己糖果，醛戊糖及己糖果醛 酸起反应，反应后溶液显蓝绿色，于620nm处有最大吸收。
2、 试剂：
（1） 2g/L蒽酮试剂 ：溶解2克蒽 酮于浓硫酸（A。R。 d=1。84；95％）；宜当日配制使用。
（2） 0。1g/L葡萄糖溶液或0。1g/L糖元溶液。
3、实验步骤
（1） 标准曲线制备
管号 1 2 3 4 5 6 7 备注
标准葡萄糖液 0。05 0。10 0。20 0。30 0。40 0。60 0。80 置水浴中
蒸馏水 0。95 0。90 0。80 0。70 0。60 0。40 0。20 置水浴中
蒽酮试剂 3。0 3。0 3。0 3。0 3。0 3。0 3。0
沸水浴 蒽酮 加入后，将试管移入沸水浴 ，煮沸10分钟，冷却至室温
测定OD820值
含糖量 5 10 15 20 25 30 35
绘制标准曲线：以OD820为纵坐标，糖含量（ug/ml）横坐标绘制标准曲线。
或以统计方法，求出糖含量与OD820之间的相关系数，及直线回归方程。
（2）样品含糖量测定：
取1ml稀释的粗制LPS，加速度。3。00蒽 酮试剂；混匀后迅速置于冰浴 冷却。然后转入沸水浴 中煮沸10分钟表（与制备标准曲线同时进行）。冷却至室温后，测定OD820，从标准曲线中查找相应糖含量，或代入回方法求得糖果含量。
四、脂多糖抗原致敏甲醛化SRBC
1、 取粗制LPS，加0。2M PH8。0 PB液；调整多糖浓度至120ug/ml；100℃水浴 1小时。
2、 冷却至少37℃；
3、 配制6％醛化SRBC溶液；
4、 将热处理LPS与醛化SRBC等量混合；37℃搅拌作用45分钟；
5、 取出离心2000rpm10分钟；以0。01M PH7。2PBS洗澡4次；
6、 配制4％致敏血球；分装；保存于4℃备用。
7、 致敏血球质量鉴定：
（1） 自凝性测定：血球制备过程中，洗涤不彻底，或过度化等，都可引起血球的自凝。
（2） 特异性测定：与不同抗体试剂反应，确定其反应特性。
（3） 工作浓度测定 ：选择最佳最省的致敏SRBCIPYA。
附0。2MPH8。0PB溶液。
基础液A 0。2Mna2HPO4
Na2HPO4。2H2O（MW353。22） 35。61g
或 Na2HPO4。12H2O（MW352。22） 71。6g
DW 1000ml
基础液B 0。2M NaH2PO4
NaH2PO4。H2O（MW138。01） 27。6g
或NaH2PO4。2H2O（MW156。03） 31。21g
DW 1000ml
使用液： A液94。7ml ＋B液5。3ml
成功范例：沙门氏菌脂多糖抗原敏化SRBC制备；及其在单抗检测、鸡白痢等检疫中的应用。
第二节 蛋白质敏化SRBC的制备
一、 双醛化红细胞制备
1、 采绵羊抗凝血；
2、 用10倍于红细胞 压积的0。11MPBS（PH7。2）洗4—6遍；
3、 用同一PB配成8％SRBC；
4、 配制醛 化试剂：
丙酮醛 3ml
甲醛 6ml
0。11MPB液（PH7。2） 94ml
5、 将醛化试剂缓慢加入等到量的8％SRBC中；
6、 室温（20℃）缓慢搅拌17小时；
7、 PB洗三次；
8、 配成20％双醛化SRBC，加0。1％NaN2防腐；4℃保存备用。
附：醛化红细胞 的鞣酸处理亦能吸附蛋白；但其敏感性很低；经鞣酸化后；红细胞 吸附蛋白质的量显著增加；但同时加强了红细胞 的不稳定性；（请根据要求确定是否要鞣 酸化）。；容易自凝；但增强了反应的敏感度。可用1％正常免疫血清稳定之。
1、 将醛化红细胞 配成2。5％悬液；
2、 加入新鲜配制1：10000稀释的鞣 酸溶液 ；
3、 混匀后置37℃水浴15分钟；
4、 洗涤后再配成品2。5％悬液。
二、 抗原致敏
1、 取20％双醛 人红细胞 01ml；1500g离心弃上清
2、 ；沉积红细胞 加0。2M PH4。醋酸—醋酸钠缓冲液1ml，并加最适浓度（预先要测定，蛋白抗原为50ug/ml左右）的抗原1ml
3、 混匀，于45℃致敏35分钟，不时轻轻摇动使红细胞 不下沉；
4、 离心弃上清，并用20倍红细胞 压积的PB 洗4次；
5、 配成1％致敏血球，4℃冰箱保存备用。
成功范例：粘附素致敏感SRBC。
第三节 PHA试验程序
1、 V型微量血凝板上每孔加入PH7。2PBS稀释液25ul（一滴）；一个样品做一排；
2、 加入25ul杂交瘤培养上清液或其它待检血清；依次作倍比稀释；同时设立阴性；阳性对照；
3、 再加入0。5—4％致敏血球1滴；
4、 将血凝板在振荡器上，振荡30秒；
5、 置室温半小时观察结果。
第七章 免疫胶体金试验程序
1、 取样：铜网沾取细菌悬液（80亿/ml）；
2、 漂洗：PH7。4 0。05M TBS；三次；每次5分钟；
3、 第一抗体（单抗）反应：与一定稀释度的抗体应；37℃半小时；
4、 PH7。4 0。05M TBS漂洗
5、 ；与兔抗鼠IgG37℃作用半小时；
6、 先PH7。4 0。05M TBS漂洗三次；每次分别再用PH8。2 0。02M TBS漂洗三次；每次5分钟
7、 ；与羊抗兔胶体金（陕西省中医药研究院）（1：10）稀释液作用，4℃过夜，（或用SPA胶体金，宁军区医院）；
8、 先用PH8。2 0。02M TBS漂洗三联单次；每次5分钟；再用PH7。4 0。05 TBS 漂洗；每次5分钟；
9、 晾干后电镜观察。
成功范例：大肠埃希氏菌粘附抗原定位；沙门氏菌O抗原、H 抗原定位。
附：
一、负染色：常规电镜负染色法，细菌悬液浓度8亿/ml，1％PTA染色30秒钟。或铜网经0。02％GA室温处理30分钟；然后吸干；滴加培养菌液或提取抗原；用1％磷钨酸染30秒；晾干后电镜观察。
二、免疫酶染色：
1、 同前
2、 同前
3、 同前
4、 与羊抗BALB/C小鼠IgG酶标抗体作用，37℃半小时，经PH7。4 0。05M TBS漂洗后；与底物溶液作用5—10分钟，漂洗，晾干后电镜观察。
附：1、底物溶液：PH7。6 0。05M Tris—HCL缓冲液
0。125％ DAB
0。03％ H2O2
3、 1％BSA：以PH7。4 0。05M TBS配制
第八章 免疫球蛋白亚类测定的程序
第一节 免疫扩散法
单抗类和亚类鉴定的常用方法
一、 试剂
1、0。06M巴比妥钠—盐酸缓冲液 PH8。6
（1） 0。06M巴比妥钠（MW 206。18） 1。237g
D。W 100ml
（2） 0。2N盐酸溶液
浓盐酸 1。68ml
DW 至100ml
（3） 0。06M巴比妥钠—盐酸缓中液PH8。6 取（1）液化气100。00ML；用力。2N盐酸溶液调节PH至8。6（大约用4。00ml）
2、1％agarose
agarose（B。R。） 0。8g
0。 06M巴比妥钠盐酸缓冲液80。0ml
隔水煮 沸溶化。
5、 羊抗小鼠IgG亚类血清
IgM， IgG，IgG32，IgG24，IgG2
二、 方法
1、 浇琼脂糖板，每片约3ml；
2、 琼脂糖板打孔（孔径为1—2mm，孔间距离3—5mm），挑出孔内琼脂后，补孔；
3、 向中央孔注入抗Ig亚类抗血清，周围孔加入待测样品（1：20稀释腹水样品，或20倍浓缩的培养上清），每孔2—3ml；
4、 置湿盒内室温下扩散或4℃过夜观察沉淀线，判定结果。
附：（1）20倍浓缩的杂交瘤培养上清的制备。最简单方法是将20ml培养上清倒入一平皿，电扇砍风蒸发浓缩至于ml，或装过透析袋，用PEG6000或蔗糖吸水；
或以浓缩胶吸收上清中水份。
单克隆浓缩抗体是上清中在的叭一的小鼠Ig，因此，浓缩培养上清是鉴定Ig类和亚类的最好材料。
（2）20倍稀释的杂交瘤腹水
因为腹水中含有小鼠正常Ig，所以用腹水（或血清）鉴定单抗类和亚类，可能会得到模棱两可的结果，在大多数情况下腹水经过1：20稀释后，其中的正常Ig浓度变得很低，不易被免疫力扩散测出。
第二节 ELIST法
1、 用EPBA稀释山羊抗菌素小鼠Ig至工作浓度；酶标板每孔加入100ul，37℃孵育2小时。
2、 用PBST洗涤3次。
3、 每孔加200ul 1％BSA EPBS 37℃1小时。
4、 PBST 洗涤2次。
5、 加100ul杂交瘤上清液，37℃2小时，或4℃过夜。设立阴阳对照。
6、 PBST洗4次
7、 分别加入100UL多种兔抗小鼠Ig亚类特异血清，每种至少重复（）孔，37℃2小时。
8、 PBST洗4次
9、 加100ul HRP标记的羊抗兔Ig，37℃2小时。
10、 PBST洗4次。
11、 每孔100ul OPD底物显色，室温作用15分钟，2M浓H2SO4终止反应。
12、 肉眼观察结果，或测OD490值判定结果。
第九章 免疫血清的制备
第一节 免疫球蛋白提取与纯化
一、 试剂
1、 饱和硫酸铵：500g（NH）2SO4（A。R。）加入500ml D。W。中，加热至完全溶解，室温过夜，临用前用2N NaOH调pH至7。8。
2、 32％硫酸钠溶液：72。6g NaSO4。10H2O 溶于60…80ml D。W。中，定容至100ml
3、 16％硫酸钠溶液：50ml32％硫酸钠溶液加于50mlD。W。，混匀。
4、 2N NaCl
5、 2N NaOH：16gNaOH＋200mlD。W。
6、 0。5NnaOH：20gNaOH＋1000mlD。W。
7、 2％NaHCO3（煮透析袋用）：8gNaHCO3＋400mlD。W。
8、 PBS （10mMNaH2PO4_Na2HPO4；10mMNaCl PH6。8）：
Na2HPO4。12H2O 17。55g
NaH2PO4。2H2O 7。96g
NaCl 5。84g
D。W。 10000ml
9、0。5M氯化钡溶液（检测SO42…）氏试剂
10、萘氏试剂（Nesslers reagent）：
碘化汞 115g
碘化钾 80g
D．D．W．（不含氨）500ml 待溶解后，过滤，滤液中加入20％NaOH500ml。
测定时，取样品3—4ml，加入上述萘氏试剂1—2滴，若有铵离子存在，则出现砖红色反应，甚至可发生棕色沉淀。
二、 免疫球蛋白（IgG）粗提
所得粗制Ig，可以作为免疫原，可用作标记抗体制备。
（一） 硫酸铵沉淀法
适用于鼠、兔、猪、羊、鸡等血清或抗血清和小鼠单搞腹水中Ig的提取。此方法为盐析法提取Ig的首选方法。
1、 取10ml血清、抗血清或胜地水，10000rpm15分钟，去除细胞碎片及其它颗 粒物质。
2、 将上清转移于小烧杯中，其内置磁棒，于磁力搅拌器上轻搅拌。
3、 滴加饱和硫酸铵（PH7。8）5。0ml；加时应缓慢；每加一滴后应待混匀后再加下一滴。
4、 继续轻轻缓慢搅30分钟；注意避免产生气泡。
5、 10000rpm15分钟。
6、 弃去上清液；沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮；10000rpm15分钟
7、 。重复步骤6二次
8、 。最后一次洗澡后的沉淀溶于1。5mlPBS中。
9、 于透析袋内过夜透析（4℃）。其间换液3—5次，直至检查不到NH4（）和SO4（）。
10、 移出蛋白质溶液，1000rpm15分钟，收存上清液即为粗提免疫球蛋白。
或将蛋白质溶液经SephadeX G25 或G50层析过程，均以PBS作平衡液和洗脱液。
11、 收集第一峰，测定蛋白质含量（mg/ml）。
＇Pr＇=（1。45XOD280—OD290X0。74）X稀释倍数
OD280
或＇Pr＇=——————X稀释倍数
1。3
或＇Pr＇=1。5（OD280—0。5XOD290）X稀释倍数
12、 小量分装后，4℃可长期保存，亦可—20℃冻存或冻干保存。
13、 提纯的Ig保存要求PH中性，盐浓度过100—200Um，蛋白质1—10mg/ml，加防腐剂。此外，使用或分离Ig的温度最好是2—4℃。特别是鸡、小鼠、大鼠等要比其次动物Ig更不稳定，因此，在处理这类Ig时特别当心。
（二、）硫酸钠沉淀法
适用于兔和鸡血清中的Ig提取，但该不稳定。
1、2、同前
3、滴加速度32％Na2SO4溶液10ml，滴加时应慢，每加1滴后待混匀后再加下一滴。
4、继续缓慢搅拌30分钟。
5、 10000rpm15分钟。
6、 弃去上清液，沉淀物用16％Na2SO4悬浮，10000rpm15分钟。
7、 重复步骤6二次。
8、 以下步骤同前。
附一、 不同动物血清球蛋白硫酸铵盐析浓度参考值
血清来源
硫酸铵饱和度（％）
家兔
山羊
绵羊
小鼠
大鼠
鸡
马
猪
33X3次
30X1，33X2
33X3
33X1，40X2
35X1，40X2
33X3
30X1，45X1
33X3
30X1，45X1
33X3
附二 透析袋处理
1、 透析袋于2％NaHCO3＋1Mm EDTA 中煮10分钟。
2、 用蒸馏水洗透析袋子内、外表面。
3、 再用蒸馏水煮10分钟。
4、 冷至室温即可使用。如暂时不用则将透析袋浸于0。2MEDTA溶液中，4℃存放。
5、 使用后的透析袋用 DW反复部洗后，同上法处理，浸于0。2M EDTA溶液，4℃存放。
6、 注意事项：
（1） 透析袋亦可高压灭菌消毒。
（2） 吸取或装入透析物时，手指不能直接接触透析袋，应戴一次性手套或使用镊子。
（3） 透析袋用应及时洗涤、 处理，以便重复使用。注意节约。
三、 免疫球蛋白的纯化
（一） 离子交换柱的制备
1、 20g DEAE…纤维素（whatman DE 32）浸泡于200ml 0。5NHCL；0。5小时，中间搅动两次。
2、 用蒸馏水反复抽洗，直至PH接近D。W。的PH值。
3、 用200ML 0。5N NaOH浸泡15分钟，中间搅动两次。
4、 抽去液体。
5、 将湿胶再用功200ml 0。5NaOH悬浮，浸泡15分钟，然后抽去液体。
6、 重复步骤5
7、 将湿胶再用D。W。反复抽洗 ，直至抽出液PH值接近D。W。的PH值。
8、 再用起始缓冲液反复冲洗，直至抽出液的PH值勤和导电值与起始缓冲相同。
9、 在装柱前，去除微细颗粒。柱底填一些玻璃棉，上面再放置一层Washed sand或glass beads以防cellulose流出柱。
10、 用缓冲液淋洗，使柱床稳定（2。0 ×30cm）流速1…3 ml/分钟或20滴/分钟。
（二） 纯化免疫球蛋白
1、 将脱盐后的粗蛋白对离子交换柱加样。注意每克DRAE…纤维素能受的蛋白质为了30—50g。
2、 梯度洗脱（0…300M NaCL）；用自动部分收集器分管收集，每管5ml。起始液为PBS（0。01M PB；0。01M NaCL；PH6。8）或（0。01M Tris—HCL PH6。8）。
3、 测定蛋白测量，分装…20℃冻存
4、 此法提取的主要是IgG ；但可能会混有β…球蛋白。每毫升血清或腹水可提得Ig3…10mg
5、 若需进一步提纯，可过Sephacryls…300柱层析
（86…123）缺
（三） 凝胶再生的方法
1、 洗脱出第一蜂后，用2N NaCL淋洗至基线稳定，再用起始缓冲液抽洗至洗出液的电导值与缓冲液相同，重新装柱使用。
2、 如再生胶暂不使用，应加防腐剂，置4℃保存，下次装柱应抽洗去除防腐剂。
成功范例：羊抗鼠IgG，各种单抗、猪、鸡、小鼠等血清中IgG。
四、 亲和层析一步法提纯IgG
1、 每5ml湿胶（1。5g干粉）可以经合100—125mg IgG。
2、 血清或腹水或杂交瘤培养上清加样后，以PBS充分洗涤，至记录仪基线稳定。
注意：直接使用腹水，可能会因纤维蛋白而阻断亲和力。
3、 以0。1N甘氨酸—HC L，PH2。5作为洗脱液；注意在PH2。5不稳定的抗体；应考虑用较高PH 进行洗脱。
4、 迅速以1M Tris—HCL PH8。0中和洗脱的提纯Ig（亦可透析中和）。柱再生。
5、 以下步骤同前。
成功范例：提纯兔抗鼠IgG。
附一、 不同IgG亚类与SPA结合与洗脱的条件
IgG亚类
来源
结合
洗脱
IgG1
IgG24
IgG24
IgG9
小鼠
小鼠
小鼠
小鼠 PH》8。0
PH》7。0
PH》7。0
PH》7。0 PH