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（二） 兔抗血清的制备
程序一：
1、 每只家兔上内多点注射50—200ug蛋白抗原（FCA—Ag）。
2、 1个月后，用提纯抗原静脉注射0。5mg蛋白抗原。
3、 2周后试血；效价不够；可加强免疫一次。。
4、 于最后一次免疫2周后，心脏采血致死，分离血清，分装—20℃冻存备用。
成功范例：兔抗大肠埃希氏菌粘附素血清
程序二：
1、 第一次静脉、腹腔各注射50mg/只差速离心粗提NDV抗原。
2、 第7天重复注射一次。
3、 第14天改为腹腔、肌肉注射器，剂量加倍。
4、 第21天肌肉注射100mg/只，四脚掌各10mg/只。
5、 末次注射后10天采血，分离血清。测HI滴度计算血凝抑制单位。
（三） 鸡抗NDV血清制备
第一次用Lasota株鸡胚尿囊液静脉注射1ml/只，腹腔注射4ml/只，以的每隔5天重复注射二次（内含1mlNDV强毒鸡胚尿囊液），共三次，末次注射后第10天采血，测HI滴度。
（四） 小鼠抗血清抗原的制备
程序一：可溶性抗原的免疫程序
1、 以10—100ug抗原乳化在200ulFCA中（油包水），腹水注射3—12周龄BALB/C小鼠。
2、 4—6周后，以同样剂量抗原乳化在FIA中，作1—2次追加免疫（i。p），间隔时间为2—3周。（可试血、采血）。
3、 以等量或加倍量抗原的PBS 溶液作最后一次免疫，2—4天后取脾细胞可作融合试验用。
程序二：细胞性抗原的免疫程序
1、 细胞用PBS洗3—4次以除去血清成分。
2、 以10（7）细胞/只剂量腹腔注射BALB/C小鼠。
3、 3—8周后作追加免疫力。（可重复1—2次）。
4、 最后一次免疫2—4天取脾细胞供作融合。
程序三：短程免疫程序
1、 全菌抗原5X10（6）/只腹腔注射；（或用提纯抗原40ng/只 i。p）。
2、2—3周后，腹腔注射提纯抗原40ng/只（若每间隔2—3周用全菌抗原后提纯抗原加强免疫5—6次，此乃“密集型”免疫程序）。
2、 3天的取脾细胞可供融合用。
（五） 体外免疫程序
Development of a serum—free medium for in vitre immune responses by using b—cyclodextrin
J Immunol Methods 1998：112：227—233
（六） IBDV血清生产（从略）
第十章 细菌学试验中的几个常用技术
第一节 ；菌总数估测
一、 比浊法
1、 莫法兰德浊度计的制备
按下述方法制备标准硫酸钡悬液。
（1） 制备一份1％的C。P（化学纯）硫酸溶液。
（2） 制备一份1％C。P氯化钡溶液。
（3） 制备下述10个标准悬液：
加（1％氯化钡溶液ml数）于（1％硫酸溶液ml数）
1 99
2 98
3 97
4 96
5 95
6 94
7 93
8 92
9 91
10 90
（4） 取各标准硫酸钡沉淀的悬液3ml左右，封存在一支试管内。试管必须仔细挑选，使其直径、色泽和管型的厚度都一致。
2、 目测待检样品与几号管浊度相近，并按下列关系，估计细菌浓度：
管号 细菌含量
1 3亿
2 6亿
3 9亿
4 12亿
…… ……
二、 常规平板计数法
1、 将待测均质样品制备10（…2）10（…3）10（…4）……等适度的十进制稀释液，其方法系以无菌吸管吸取10ml原稀释液，加于90。0ml稀释液中（有时可采用1。0ml＋9。0ml）混匀。注意：稀释每个滴度的吸管都要更换，操作中防止出现泡沫。
2、 用吸管以每一个稀释液内吸取1。0ml，分别加入到有适当标志的平皿（15mm X100mm）内。注意：如果稀释菌液静置的时间超过3分钟，则在吸取前，必须重新混匀。
3、 于每个平皿内各加12…15ml标准法琼脂（冷至44…46℃。琼脂在45℃水浴中保温备用）样品的每一个稀释系列做一个只加稀释剂倾注琼脂的对照平板。
4、 立即转动或在一个平面上前后倾动平皿，使样品稀释液和琼脂培养基充分混合均匀。
5、 待琼脂凝固后，翻动平板，迅速防于35℃恒温箱内培养 48h＋（…）2h。
6、 培养后，在适当范围的双列平板用菌落计数器计数菌落数，记录每一个稀释度的平板计数结果。
7、 在三个稀释倍数中，至少应有一个稀释倍数的两个平板其菌落数在30—300个的范围之内。根据菌落数和稀释度计数样品中的需要平板数。
8、 所有从菌落数少于30个或多于300个的双列平板计算而得的需氧平板计数数，都报告为估算数。
附：1、标准法琼脂（平板计数琼脂）
胰蛋白胨 5g
酵母浸膏 2。5g
葡萄糖 1g
DW 15g
PH7。0＋（）0。1 121℃15分钟
2Butterfield氏缓冲液
基础溶液：
磷酸二氢钾 34g
D。W。 500ml
用1N氢氧化钠将PH值调整至7。2，加蒸馏水至升。121℃高压灭菌15分钟，贮于冰箱。
稀释的定量瓶装（使用液）：
取上述基础液1。25ml；加D。W。达1000ml；分装于瓶内；每瓶99或99＋（）1ml。
121℃高压灭菌15分钟。
三、 直接显微镜检查法（Official first action method，法定试行方法）。
1、 在油镜下用显微镜测微尺测定每个视野的直径d，则视野的面积为：
Af=（）（d/2）（）。
2、 每一平方厘米涂膜的视野数应为
AF 1cm（）
——— =——————
Af Af＇cm＇（）
3、 每个涂膜含0。01ml样品；则1。0ml样品的视野数应为：
AF
FF=100X————
Af
4、 每ml样品中的菌数即为：
DMSCC（）/ml=＇FF＇X＇每个视野的平均菌数＇
（direct microscopic somatic cells count 直接显微镜菌体细胞计数）
5、 FF和检查的视野数（至少10—60个）都为已知数，故可作为一个系数，称视野工作系数（FWF）代入上式而得：
DMSCC/ml=＇FWF＇X计数的总细菌数
6、 菌液涂膜的制备：
（1） 吸0。01ml样品；置于洁净、干燥的载玻片上；
（2） 将菌液涂成1cm（）的涂膜；
（3） 将玻片放于35—40℃，至涂膜干燥；注意保持玻片的水平。
（4） 浸于二甲苯中1min，再浸于95％酒精中1min；
（5） North苯胺油亚甲蓝染色剂中染色1—20min；
7、 漂洗玻片，镜检前在空气中充分干燥。切忘用吸墨纸吸干。
附：North苯胺油—亚甲蓝染色液
苯胺油（Aniline Oil） 3ml
酒精（95％） 10ml
盐酸（浓） 1。5ml
亚甲蓝（饱和溶液） 30ml
蒸馏水；加至 1000ml
将3ml苯胺油与10ml酒精相混合；在不停在搅拌下徐徐加入1。5ml盐酸。。加30ml饱和亚甲基蓝溶液，用水稀释至100ml，过滤。
四、 分光光度计测定法
a、 波长选择420nm，550nm，600nm。
b、 下列回归方程为420nm条件下建立。
第一组
（1） 大肠杆菌
lgy（）=7。1370＋2。7878X
（2）金黄色葡萄球菌：
lgy（）=7。4722＋4。7259X
（3白色葡萄球菌：
lgy=6。9067＋2。6950X
（5） 白色念珠菌：
lgy=5。9512＋2。1948X
有效测定范围在103___106ofe/ml
（摘自俞晓峰文章）
第二组
（1） 沙门细菌（S。pullorm）
未离心肉汤：lgy=7。3461＋7。5306X
离心菌悬液：lgy=7。3112＋7。7191X
（2） 大肠杆菌：
未离心肉汤：lgy=7。4197＋1。2113X
离心菌悬液：lgy=7。3764＋5。8632X
五、最近似数（MPN）（the most probable numbers）是一个代表作用物中活菌浓度的估计数。这个数是应用机率的原理测定作用物（样品）中细菌的总浓度而推知的。请参阅有关文献。
第二节 几种常用细菌培养基的配方
一、Minca Med 1000ml（Minca—Isoritalex）
KH2PO4 1。36g
NA2HPO4。12H2O 25。3g（NA2PO4。12H2O 10。1g）
Casamino acids 1g （Difco）
Trace salts solution’ 1ml’
agar（Difco） 12g
PH7。5 10P。10分钟消毒
（Isoritalex（BBL）：1 ampoule）
*Trace salts solution（100ml）
MgSO4。7H2O 10g
MnCl2。4H2O 1g
FeCl3。6H2O 0。135g
CaCl2。2H2O 0。4g
100℃灭菌。
二、SLANETS MEDIUM
Bacto tryptose 20g glucose 1g
NaCl 9g bacto agar 18g
A．D．W 1000ml
四、 BBL培养基
（1）大豆胨 10g
Trypton or Bacto—pepton
orpretose—pepton 10g
NaCl 4g
KH2PO4 1g
牛肉汤 1000ML
agar 20—30g
PH7。6 15磅 15分钟灭菌
或（2）Trypton or Bacto—pepton 10g
NaCl 3g
NaH2PO4 2g
兔汤 500ml
牛肉汤 500ml
agar 20g
PH7。6 15P15’
或（3） 酪蛋白水解物 20g
大豆胨 10g
NaCl 3g
NaH2PO4 2g
PH7。6 15P 15’
四、TEM Med
Lab__Lemco 5g
bacto__tryptose（Difco） 10g
NaCl 3g
Na2HPO4。12H2O 2g
glucose 0。5g
yeast extract（Difco） 5g
*Trace element solution 5。0ml
PH7。3
bacto agar（Difco） 25g
A。D。W 1000ml
120℃ 15’
*Trece ekement salt
FeSO4。7H2O 0。5g
ZnSO4。7H2O 0。5g
MgSO4。3H2O 0。5g
1N H2SO4 20ml
A。D。W 1000ml
五、 M肉汤
1、Trypticase soy Broth
Trypticase 17。0g
phytone 3。0g
Glucose 2。5g
15p。s。i for 15min
Dipotassium phosphate 5。0g
D。W 1000ml
PH7。3
2、Tryptone Broth
Trytone 10。0g
D。W。 1000ml
3、M broth
an equal mixture of（1） and （2）
六、 其它各类培养基参见有关书籍。
第三节 常见细菌的分离鉴定
按常规程序进行各类细菌分离鉴定，请参阅有关书籍。这里仅以肠杆菌科沙门细菌的分离鉴定为例简要概述，下面是该菌的分离鉴定的流程图：
被检材料
内脏组织上 粪便、肠内容物理学 各类食品、饲料等
前增菌
增菌培养（24—48小时）
选择性增菌
鉴别培养基（24h）
三糖铁琼脂（24h）
几次常规生化 尿素酶 多价抗O血清
试验鉴定 测定 试验
ELESA试验、
结果判定 FA试验、噬菌体系统
DNA杂交试验等
动物试验 O单因子血清测定 鉴别生化试验
H血清鉴定
结果判定
第十一章 细胞免疫学试验程序
第一节 玫瑰花环试验（E—ROSETTES ASSAY）
一、总E花环（ERYTHOCYTE TOTAL ROSETTE，Et），或称晚期玫瑰花环，淋巴细胞＋SRBC等，37℃，低速离心——4℃ 2小时——检测。
E的百分率（花环形成的细胞X100/总计细胞数）和绝对数可代表被检标本中全部T淋巴细胞的百分数和总数。E是目前鉴定和计算外周血液和各种淋巴样组织中T细胞的最常用方法之一。
二、活性E花环（ERYTHOCYTE ACTIVE ROSETTE， Ea），或称早期玫瑰花环。淋巴细胞＋SRBC或其它动物红细胞——低速离心沉淀——检测。
Ea与T细胞的体内外功能活性密切相关，能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化，是目前检测细胞免疫水平最为简便快速的方法之一。
三、 操作步骤
1、 静脉采血，以肝素作为抗凝剂，每毫升血含20UL或0。2mg；若为以EDTA—Na2作抗凝剂1—2mg/ml血。一般认为EDTA—NA2比肝素好，因为T淋巴细胞、RBC、肝素均带负电，有相互排斥。
2、 淋巴细胞的分离 淋巴细胞比重在1。077___1。080之间；红细胞和粒细胞比重为1。092。配制1。077___1。080高分子液进行密度梯度离心；高分子溶液的主要成分是蔗糖；商品名为FICOLL
取抗凝血1。0ml；加等量HANK’S液（无钙镁；PH7。4）稀释后；用毛细吸管沿管壁缓慢加入装有淋巴细胞分层液的试管内；使血凝重叠于分层液上；用水平离心机以2000R/M30分钟离心。此时红细胞沉降至最下层，上层为血浆，中层为分层液，血浆与分层液的界面有一白色挟带为淋巴细胞和单核细胞。
以毛细吸管吸取界面处的淋巴细胞与单核细胞，置于离心管中，用HANKS液以1000r/m10分钟洗2次，以HANKS液配成107个细胞/ml的细胞悬液。
3、1％RBC悬液的制备 取阿氏液保存的血液，以HANKS液洗3次，2000r/m10分钟离心后，将压积红细胞用HANKS液配成1％悬液，含红细胞数约108/ml。
6、 Ea花环0。3ml淋巴细胞悬液＋1％RBC 0。3＋0。1ml灭活小牛血清___混匀___37℃25分钟___1500r/m5分钟___此培养物即可作涂片或滴片观察。
5、E1花环：上述培养物中再加入0。8％戍二醛1滴；轻轻摇匀混合；置4℃冻箱中作用2小时（或过夜）。取出后，轻轻旋转试管，使沉淀的细胞重新悬浮，用毛细管轻轻混匀。
7、 制片镜检
（1）湿片 取上述培养物一滴加于事先铺有瑞氏染液的玻片上，覆以盖玻片，在高倍镜或相差镜下观察。凡吸附4个或更多RBC的单核细胞为RE花环形成细胞，共计数200个细胞，算出百分率。
（2）干片 取培养物1滴于载玻片上涂片、干燥，滴加甲醇固定5分钟，用PH6。4PBS冲洗；取I液染4分钟；冲洗；再加II液染色4分钟；冲洗；待干；镜检。红细胞染成红色，淋巴细胞染成蓝色。
附1 染液配方
I液 瑞氏粉0。1g；甲醇60ml；研碎混匀。
II液 姬姆氏粉0。5g；纯甘油33ml；甲醇33ml；先将姬姆氏粉溶于甘油中；并置60℃温箱中；最后加甲醇即可。
使用时；分加将I液和II液用PH6。4PBS稀释一倍。
附2 试验条件选择
1、 人、猪、牛、羊淋巴细胞——SRBC：
2、 马、犬淋巴细胞—豚鼠RBC：
3、 豚鼠淋巴细胞——家兔RBC：
4、 RBC：LC=50—100：1
5、 染液亦可用0。2％美兰； Giemsa ___Wright氏液。
第二节 淋巴细胞转化试验
（LYMPHOCYTE TRANSFORMATION TEST）
淋巴细胞转化试验是体外检测淋巴细胞功能的一种方法。Tc与特异性抗原或非特异促分裂因子在体外共同培养时，细胞代谢和形态发生一系列的变化，代谢旺盛、蛋白质和核酸的合成增加，细胞体积变大，转化为能分裂的淋巴母细胞。转化率的高低反映机体的免疫功能状态，这种方法为淋巴转化试验。
一、试剂