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免疫球蛋白
SPA
免疫球蛋白
SPA
小鼠IgG1
IgG24
IgG24
IgG6
IgM
IgA
IgE
兔IgG
鸡IgG
＋（—）
＋
＋
—
—
—
—
＋
— 山羊IgG1
IgG2
绵羊IgG1
IgG2
猪IgG
猫IgG
豚鼠IgG
—
＋（—）
—
＋
＋
＋
＋
—
（二） 羊抗鼠Ig交联Sepharose 4B以提纯小鼠Ig
注意：溴化氰易挥发，如果吸入或通过皮肤吸收有巨毒，所有接触CNBr设备应浸在NaOH中，在通风橱里过夜，然后将氰化物洗掉。
1、 以1升水用真空抽滤的方法Sepharose 4B（10ml沉淀体积），去除防腐剂（不要完全抽干），重悬于水中，总体积为18ml，置于50ml的烧杯中。
2、 加入2ml碳酸盐冲液（0。5M碳酸钠PH10。5）和磁力搅拌 子；在通风橱中搅拌；将PH 电极置于悬液中；检查搅拌器和PH计的工作情况。
3、 戴好手套；小心将1。5克CNBr（避免大颗粒）倒入小瓶中。（在通风橱中完成这项工作是安全的，先称小瓶和瓶盖子的重量，然后在通风橱中往小瓶中加CNBr，小心盖紧盖子，移出通风橱称重，原来装CNBr的瓶子的药勺留在通风橱中）。
4、 缓慢的搅拌Sepharose悬液，监测PH并加入固体CNBr（将药勺和空小瓶置于1M NaOH中），逐滴加入4M的NaOH 以保持PH在0。5—11。0；直至固体CNBr全部溶解以及PH降低的速度减慢（10—15分钟）。
在此过程中如果PH高于11。5；则弃去Sepharose；重做。
5、 用烧结玻璃或布氏漏斗过滤混合物，用2升冷柠檬盐缓冲液（0。1M PH6。5柠檬酸钠；预冷却至4℃）迅速洗涤Sepharose（不要完全干）；小心处理过滤器（含CNBr）。
6、快速将活化的Sepharose加到IgG溶液（100mg溶于10ml柠檬酸缓冲液中置于
4℃）中，置于转动混匀器上，使之不断的轻轻混匀，4℃
过夜。如果没有转动混匀器，则轻轻搅拌混合物1小时，然后静置过夜）。
7加1ml乙醇铵溶液，继续轻轻搅拌1小时，以确保安全去除活性基因。
8让Sepharose自然沉降，上清用500g离心5分钟，在280nm测上清液吸光度，计算未偶联到Sepharose上的IgG百分率。假设上清液的总体积为11ml（蛋白溶液＋乙醇胺）加5ml（10ml Sepharose的内部液体体积）。IgG未偶联率小于10％，通常为1—5％。
9、将IgG—Sepharose 装于合适的柱（可将多孔圆盘放在注射针筒骨来制造一个简单的柱）中，用PBS洗涤，柱中加入含0。1％叠氮钠的PBS；4℃
保存。
10分离提纯Ig同前述可参阅有关资料。IgG—Sepharose有时要用同类动物正常Ig封闭之。
成功范例：提纯培养上清中的单抗。
第二节 几种常用抗原的制备
一、 脂多糖抗原制备
（一） 粗制LPS制备，参见第六章
（二） 精制LPS制备
1、 粗制LPS经3倍95％酒精，37℃水浴作用15分钟；离心后，沉淀物以蒸馏水配成3％溶液。
2、 超速离心100000Xg 4小时。上层为上清液，中间层为沉淀的LPS胶体，下层为粘液样沉淀物。
3、 吸弃上清，小心取出沉淀物的LPS胶体（中间层）。
4、 将LPS溶解在原体积的1/2蒸馏水中，再离心一次。
5、 沉淀的LPS溶液于少量DW中，冻干保存。
超离后分层情况
（三） 多糖抗原制备：
1、将LPS 200mg溶解在20ml 1％醋酸溶液中，以移入带塞的试管中。
2、 100℃水浴30分钟。
3、 5000Xg离心沉淀类脂，吸取上部液体，装入透析袋中，4 ℃透析48小时。
4、 冻干提取的多糖，产量为LPS的30——、40％。
成功范例：沙门氏菌A—F群LPS提取。
二沙门氏菌鞭毛抗原的制备
1、将半固体培养基筛选活泼动力的单相沙门氏菌血清型接种到10mlM肉汤中，37℃
16小时。
2、 再移种到500ml M肉汤中，37℃16小时。
3、 400ur/m离心30分钟，收集细菌。
4、 以适量生理盐水悬浮菌泥，并用1N盐酸调至PH7。0；室温轻度振荡30分钟。
5、 1000r/m 30分钟。上清中含有大量脱落下来的鞭毛素。
6、 以1NnaOH将上清调至PH7。2。
缓慢加入饱和硫酸铵溶液；边加边搅拌；达67％饱和硫酸铵浓度后；4℃过夜。
8次日将上清以15000r/m4℃离心20分钟。
9、 将沉淀物溶解于2ml蒸馏水中。
10、 过Sephacryl S300层析柱（2。0X50cm）；用Tris—HCL缓冲液洗脱，流速20ml/小时，收集第一峰，测定蛋白质浓度，分装保存。若对提纯要求不高，可以省略此步。
11、 提纯鞭毛素的质量鉴定
（1） SDS—PAGE：在非降解和降解条件下于10％凝胶SDS——PAGE垂直板上电泳（KB—2301电泳仪），恒流，25Ma/板，10℃电泳5小时。
（2） 凝胶用三氯醋酸溶液固定过夜色。用考马斯亮兰G—250染色。
（3） 计算蛋白带分子量：Ha 50000，Hb 53000，Hd46000。
12提纯鞭毛素的等电点测定—IEF
（1） 取60ul样品溶解在9M脲和1％2—巯基乙醇中。
（2） 上样于含有2％Ampholin（PH3。5—9。5）（LKB Bromma，Sweden）和6M脲的4％聚丙烯酰胺凝胶（用22。2％聚丙烯酰胺和1。4％ 双甲丙叉烯酰胺原液配制）。
（3） 蛋白质在LKB 1117—003多功能电泳仪上，恒流4mA待电聚焦至电压250—300V。
（4） 电泳5小时后，用10％三氯醋酸固定凝胶，经40％乙醇洗涤后，用0。1％考马斯亮兰G250染色过夜；再用14％醋酸脱色。
（5） 确定PH梯度凝胶，从阳极端切成0。5cm长度；分别装入小试管内；加去离子水1小时后；用酸度计或PH试纸测PH值；划出PH梯度斜线；并确定样品的等电点。（Ha5。1；Hb5。1 Hd4。9）。
三、 粘附素抗原的制备
（一） K88、K99和K987p的制备
1、 将G—7或E68、C83907和UP001在37℃培养16—20小时。
2、 从克氏瓶中洗下，用0。1M PBS（PH7。0）悬浮。
3、 62℃水浴振荡20分钟使粘附素脱落。
4、 8000r/m20分钟，其上清液用10％乙酸调PH至4。5，4℃放置过夜，使K88粘附素沉淀（等电点沉淀）。
5、 以8000r/m离心，将沉淀物用0。1M PBS溶解。
6、 经Sephadex G200柱层析（2。6X80cm）纯化，用0。01M PBS（PH7。0）作为平衡液及洗脱液；流速为1ml/分。
7、 收集第1峰；合并前半峰即为纯化K88抗原。。
8、 测定蛋白质浓度，小量分装，—30℃保存备用。
（二） K99抗原的制备
1、 K994529在Minca培养基上37℃培养18小时。
2、 磷酸盐尿素缓冲液洗下菌细胞。
3、 60℃加热孵化20分钟，离心后去菌体，上清加60％饱和硫铵，4℃搅拌2小时。
4、 离心收集沉淀，悬浮沉淀对上述缓冲液透析16小时。
5、 进一步经Sephadex CL—4B柱层析纯化，浓缩后再经SephadexG—50脱盐。
（三） 987P抗原的制备
1、 C88710 Slane培养基37℃20小时培养。
2、 生理盐水洗下菌笞，离心收集菌体。
3、 菌泥中加入400ml含2M尿素0。01M PBS，60——63℃ 1—1。2小时。
4、 60％饱和度硫酸铵沉淀离心上清。
5、 离心后，沉淀物再过Sepharose 4B柱。
6、 收集第一峰前半峰，浓缩后经Sephadex G50脱盐。
（四） F48抗原的制备
1、 C95707、C85919和B41M分别接种Minca培养基上，37℃18小时。
2、 灭菌0。05M PH7。2 PB收集菌体。
3、 62℃水浴加热处理1小时，并不时振动，离心去菌体。
4、 上清置4℃72小时，等电点4。6沉淀 法使粘附素沉淀 。
5、 离心后；将沉淀于Separose CL—4B纯化，以含2M尿素0。05M PH7。2 PBS洗脱；洗脱液浓缩后再脱盐。
附：各种粘附素等电点。
K88 4。2
K99 9。7
987P 3。7
F41 4。6
四、 全菌抗原的制备
1、 丙酮灭活菌制备参见前述。
2、 甲醛灭活全菌制备：以0。4—0。6％甲醛生理盐水与新鲜肉汤培养物等体积混灭菌，经PBS洗涤后，配成1—10X10（6）/ml，4℃保存备用 。
3、 热灭活全菌制备：将鲜培养物以DW稀释至10亿/ml细菌，100℃水浴2小时，离心吸取上清（另一种抗菌原），菌泥进一步用PBS洗3次，保存备用 。
4、 酒精灭洗全菌制备。
五、 病毒抗原的制备
（一） 鸡新城疫病毒提纯—“层析法”
1、 鸡红细胞吸附释放法。
鸡红细胞 吸附表面有一种糖蛋白受体，在4℃时，病毒被吸附到红细胞 膜的受体上，但在37℃时病毒的N—乙酰神经氨酶破坏受体的糖苷键后，病毒又可以从红细胞 膜 上释放。操作步骤如下：
（1） 感染病毒的鸡胚囊液，在4℃下6000r/m，30分钟，弃沉淀。
（2） 上清液根据病毒血凝滴度的高低，加入1—3％的新鲜洗涤的鸡红细胞，在4℃下吸附1—2小时。
（3） 3000r/m0分钟，弃去上清。
（4） 吸附有病毒的红细胞重悬浮于1X钙盐水中（含4％CaCL2的生理盐水），在37℃下放置2—4小时。
（5） 3000r/m20分钟取上清。
（6） 28000r/m小时，沉淀重悬于小容积的生理盐水中，即为初步纯化病毒。
2、 解脱后的病毒蛋白液再上Sepadex G—200柱，以PBS洗脱，收集第1峰。即为进一步纯化的NDV。
（二） NDV纯化—离心法
1、 NDV种毒以灭菌生理盐水作1：100稀释，再接9—11日龄SPF鸡胚的绒毛尿囊腔内（0。1—0。2ml/胚）。
2、 37℃孵化，每天照蛋两次，收获24—96小时死亡鸡胚的澄清无菌之尿囊液，测血凝价，分装—30℃保存备用。
3、 尿囊液经5000Xg 30分钟。
4、 取上清102732Xg离心30分钟。
5、 再取上清用20％蔗糖垫底，110000Xg离心2。5小时。
6、 取沉淀用少量PBS悬浮，经10—60％蔗糖等到密度性梯度离心，91000Xg 16小时（BecKman，L7，SW28）。
7、 收集含病毒的蔗糖区带。
8、 用PBS稀释上清，110000Xg离心2。5小时。用小量PBS悬浮沉降病毒，小量分装，—70℃保存备用。
（三） NDV HN NP F蛋白制备—SDS—PAGE。
附：聚乙二醇法浓缩病毒
在病毒悬液中加入一定量的PEG6000。在此条件下，病毒可随其他大分子物质发生沉淀。操作步骤如下：
（1） 收获经病毒感染的尿囊液，6000r/m30分钟，弃沉淀。
（2） 上清液中加入7。5％的PEG 和0。1—00。4MnaCL，4℃下放置2—4小时。
（3） 6000r/m30分钟，收集絮状沉淀物，重悬于小容量的缓冲液内。
六、 MDV羽囊琼扩抗原制备，从略。
七、 IBDV琼扩抗原制备，从略。
八、 转铁蛋白制备：利凡诺—低温乙 醇分级沉淀法。
1000ml血浆
加与血浆等到体积的2。0％利凡诺（内含1％Na2CO370ml），
边加边搅拌产生黄色粘性沉淀物（为白蛋白）
校正上清PH8。1—8。2，静置3—4小时
（ 白蛋白沉淀）弃 收集上清液
加1％活性吸附利凡诺（20分钟）
抽滤，得澄清滤液
移入—10℃冷冻
用1M Hac调PH7。0—7。2
加乙醇终浓度为25％（乙醇要用Hac调PH7。0—7。2）
校正PH7。0—7。2
—60—70℃放2小时
—4℃离心20分钟（20000r/m）
（球蛋白沉淀）弃
上清冷至—8℃（调PH5。80＋（…）0。05）
加乙醇至终浓度40％
调PH5。8＋（—）0。05
—10℃放置沉淀过夜
—4℃离心，收微红色沉淀（转铁蛋白）
沉淀溶于5—10倍无热原水中（含0。9％NaCL）
分装、冻干。
称干粉重，用水溶解＇Pr＇至于10％。
用1％Na2CO3调至PH6。8＋（—）0。2；测＇Pr＇为10％
将溶液在60℃水浴恒温10小时
用除菌滤器过滤
分装5ml/瓶。
注意事项：
1、 乙醇要滴加，防止局部变性。
2、 PH要准确控制。
3、 温度控制要准确。
4、 防止铁被鏊合剂“抓”走。
5、 产品应与标准品用条件电泳鉴定。
第三节 抗血清的制备程序
一、 免疫原的配制
1、福氏不完全佐剂（Ferund’S adjuvant，implete，FIA）100克石腊油与50克羊毛脂置于盐水瓶中充分涡旋混匀，过滤除菌或高压灭菌（10P15分钟），置4℃
存放备用。（有市售产品，Sigma）
2、福氏完全佐剂（Ferund’S adjuvant ，pelete，FCA）取干粉卡介苗25—250mg
于100ml盐水瓶中草药，加10ml福氏不完全佐剂，于涡旋器上混匀30—60分钟，再加40ml福氏不完全佐剂再混匀10—20分钟，4℃存放备用。（有市售产品，Sigma）
3、免疫原的配制 取等体积的蛋白质溶液与福氏完全佐剂或不完全佐剂分别置于二支洁净灭菌试管中，用2—5ml注射器（配5号针头）吸取约1/5V的抗原溶液，将针头插入佐剂液面下，急速注入油层。置旋涡器上充分混合。用同样的方法分4—5次将其余的抗原溶液与佐剂混合。再于涡旋器混匀30分钟，然后再用注射器反复抽吸，配成油包水“颗粒”，静置15分钟后，观察管底部有无水相析出，如有水相析出，则再用注射器将水相注入油层，并混合之。
制成的油包水乳剂在免疫动物之前需检查其乳化效果，方法是：取一只烧杯装满水，滴数滴上述乳剂于水面，第一滴通常分散开而其他滴呈球状。如也分散开则表明不是油包水乳剂。
3、 一些抗原，如全菌抗原、颗粒抗原等，可以不使用佐剂而直接免疫动物。
二、 动物的选择
免疫动物的选择应考虑以下几方面因素：
1、 动物房的条件及饲养管理水平。
2、 抗血清的需要量：1只小鼠仅能提供1。0—1。5ml血；而一只山羊能提供几升。
3、 可能提供的抗原量：小鼠通常对50ug或小于50ug的抗原应答良好，山羊可能需要几mg。
4、 应考虑提供抗原的动物与产生抗体的动物之间的种系关系。多数情况下，应选用在种系上与抗原供者无关的动物来进行免疫。如高度分化的哺乳动物的蛋白抗原应选用非哺乳动物（如鸡）来生产抗血清。
5、 特别注意的是，如果所制备的抗体仅仅是用来检测蛋白质间的微细差异，如同种异型，则可用关系相近的甚至是同种动物来分离抗原和制备抗体。
6、 此外，还应考虑所选动物的年龄大小、性别、个体差异等对抗血清生产的可能影响。因此免疫动物只数不宜仅是1只。
三、 免疫程序的选择
（一） 山羊抗小鼠、兔、猪和鸡Ig免疫血清的制备。
程序一：
1、 每只山羊于两侧肩前淋巴结各注射0。5毫升（共含蛋白质量650—1000ug，混于FCA中，FCA—Ag）。
2、 1个月后，采血测效价，如琼凝扩效价未达1：32，则用二倍剂量抗原（混于FIA中，FIA—Ag）于颈部肌肉注射以加强免疫。
3、 2周后再试血，如效价仍未达到1：32，则再加强免疫（同2），直至达到1：32以上。
4、 颈动脉放血致死，分离血清，分装，—20℃保存。
成功范例：羊抗鸡血清。
附：琼脂扩散沉淀法测定血清效价。
（1） 1％琼脂凝胶：用含0。065％ NaN2、5Mmedta—Na2的0。01MPBS（PH7。4）配制1％琼脂。
（2） 抗血清以0。01MPBS（PH7。4）作1：2—1：256稀释后，加入周围孔，每一稀释度加二孔。中央孔加提取的抗原。
（3） 37℃湿盒内过夜扩散，观察结果。
程序二：
1、 每只山羊于足掌、足趾、后腿部皮下注射2mlFCA—Ag（共含蛋白质量1。2mg）。
2、 二周后，二侧腘淋巴结内注射1mlFIA—Ag（蛋白质量为0。6mg）。
3、 二周后，后腿部肌肉注射4ml FIA—Ag。
4 、二周后试血，判定标准同上。若达不到效价，继续后腿部肌肉注射4mlFIA— Ag
直至达到1：32 以上。
5、颈动脉放血致死，分离血清，分装之，—20℃
成功范例：羊抗兔血清（1：256）。
程序三：
1、 每只山羊背部皮内多点注射6mlFCA—Ag（每点30—50ul，共含蛋白质量600ug）。
2、 1个月后，颈部和后腿部肌肉注射4mlFIA—Ag（蛋白质量用400ug）。
3、 二周后试血，若效价达不到，同2继续加强免疫，直至效价达1：32以上。
4、 采血，贮存同前。
成功范例：羊抗BALB/C小鼠血清。
程序四：
1、 每只山羊颈部、腿部皮下注射4mlFCA—Ag（共含蛋白质4mg）。
2、 二周后，颈部、腿部肌肉注射4mlFIA—Ag，二周后，同法加强免疫一次（6mlFIA—Ag）。
3、 二周后试血。若效价不够，继续加强免疫，直至效价达1：32以上。
4、 采血并分离血清，贮存同前。
成功范例：羊抗猪血清
（二） 兔抗血清的制备
程序一：
1、 每只家兔上内多点注射50—200ug蛋白抗原（FCA—Ag）。
2、 1个月